2014年各国留学新政大盘点利用Excel进行单因素随机区组产比试验结果的统计分析_sunysh404:配对设计或随机区组设计之分类资料的统计分析

改善学习记忆能力和防治学习记忆障碍的中药的制作方法

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专利名称:改善学习记忆能力和防治学习记忆障碍的中药的制作方法技术领域:本发明涉及中医药研究开发利用领域,具体涉及一种益智中药新方,具有明显改善药物所致的学习记忆障碍的中药。背景技术: 学习记忆能力是人类认识客观世界的基本能力之一,也是人脑的重要功能。随着人民生活水平的逐步提高,越来越多的人开始关注自身的健康问题。目前,年轻人群由于社会竞争而导致生活工作的压力增大,有学习记忆力减退的现象;并且,随着我国步入了老龄化社会,也有越来越多的老年人因学习记忆力的减退而苦恼,有相当一部分的老年人除了罹患各种老年性疾病之外,还常有学习记忆力减退,甚至学习记忆力障碍的情况,有资料表明,约5%~15%的老年人有不同程度的痴呆症状,严重者给社会和家庭带来很大精神和经济负担。与此同时,心脑血管疾病的发病率也迅速增加,同样以老年人口为多,由心脑血管疾病引起的脑梗塞、脑缺血、脑溢血等导致血管性痴呆的病因。除此之外,由意外、创伤等引起的学习记忆障碍、甚至痴呆的情况也很普遍。而无论何种原因引起的痴呆,均可导致不同程度的学习记忆能力的减退和障碍。根据文献检索的结果,我们知道有大量文献报道中药复方可以改善动物的学习记忆障碍。但是组方药物较多,一般至少为5味以上,多的高达数10味中药,且多为自买和自煎为主,品质难以保证。发明人先前经研究得出的中药复方(自定义代号Q0409),由补肾、益气、安神、醒脑功效的7味中药组成(补肾肉苁蓉,巴戟天,干地黄;益气人参;安神茯神,远志;醒脑石菖蒲)。经研究证明具有明显改善东莨菪碱所致的小鼠学习记忆障碍的作用。但是同样具有药物较多,品质难以保证的缺点。发明内容本发明就是要对中药复方Q0409进行筛选,精简组方,提供一种药效更高的具改善学习记忆能力和防治学习记忆障碍的中药。为达上述目的,本发明采用正交分析的方法对中药复方Q0409进行深入研究,选择具有质量保证的中药免煎颗粒剂进行研究,经过多次实验,最终筛选出由以下两种药物组成的组方人参和远志。作为优选方案,所述原料药物的重量比为人参1~50份,远志1~50份。作为更佳方案,所述原料药物的重量比为人参8~12份,远志10~14份。本发明组方的最佳配比为人参10份,远志12份。所述人参包括山参、红参、圆参、党参,花旗参等品种,远志包括细叶远志或卵叶远志。所述中药可采用常规加工方法制成口服液、胶囊、片剂、提取物再混合等剂型。由于人参与三七或西洋参成分较为接近,所以本发明的中药也可由以下重量比的两种药物组成三七1~50份,远志1~50份;或,西洋参1~50份,远志1~50份。实验证明,本发明的中药新方可对抗胆碱药物——东莨菪碱小鼠腹腔注射后引起的记忆获得障碍(新药临床前研究指导原则,中华人民共和国卫生部药政局,1993年7月),是具有益智作用的中药新方。本发明的中药新方与其他益智中药复方的相比,有如下优点1、实验结果重复性好,效果肯定;2、仅有2味中药,组方药物少;3、容易获取、方便且便宜。具体实施例方式实施例1采用正交设计,以学习记忆障碍动物模型,观察行为学和相关生化指标,筛选出中药的最佳和有效组方(即Q0409筛选方进行下面的实验)昆明小鼠雌雄分笼饲养,每天自由饮食、饮水,并定时换垫料,以维持小鼠生活环境清洁卫生。同时每天定时给各组小鼠灌胃相应的中药溶液。中药免煎颗粒剂,将上述中药编号为A-G,肉苁蓉(A,0.238g·mL-1),巴戟天(B,0.238g·mL-1),远志(C,0.286g·mL-1),茯神(D,0.238g·mL-1),人参(E,0.238g·mL-1),干地黄(F,0.238g·mL-1),石菖蒲(G,0.286g·mL-1)。用双蒸水配制成不同配伍的中药溶液。上述中药A-G,每个中药为1个因素,分为加中药、不加中药2个水平(1、0)。将动物随机分组,采用记忆获得障碍实验进行中药Q0409初步筛选实验(Morris水迷宫实验)。根据L8(27)正交表将动物分组,各组小鼠每天灌胃相应剂量中药溶液,连续给药14d。第15d-19d每天先灌胃相应剂量中药溶液,1h后,每只小鼠再腹腔注射东莨菪碱(2mg/kg)后30min,开始进行Morris水迷宫实验。L8(27)正交表 注分为8组,做独立因素分析。1)第15-19d,进行Morris水迷宫测试,整个实验分为两个过程定位航行实验和空间搜索实验。①定位航行实验用于检测动物的学习和记忆获得能力。第15-18d,将平台置于东北象限的中央,每天分别从东西南北四个入水点将动物背向平台放入水中,记录动物游上平台所需时间即逃避潜伏期,历时4天,具体方法与筛选动物时相同。②空间搜索实验用于测量动物对平台位置的记忆保持能力。最后一天,即第19d,撤除平台,任选一个入水点将动物背向平台放入水中,让动物自由游泳60秒,记录60秒内动物穿越原平台区的次数及动物在各象限的游泳时间。所有行为学测试过程中,保持房间安静,光线柔和,室内参照物位置不变。2)小鼠脑海马匀浆第19d,水迷宫测试结束后,立即处死各组小鼠,取出脑组织中的海马,置玻璃匀浆器中加入预冷生理盐水制成10%(g·mL-1)脑海马匀浆,以3600r/min离心10min,取上清液,冻存待测。3)生化检测按试剂盒说明书的方法测定小鼠脑海马匀浆中的乙酰胆碱酯酶(TachE)活性和蛋白含量。测试结果1.小鼠Morris水迷宫实验的行为学指标分析1.1学习成绩数据的分析表1-1 各组动物每天在定位航行实验中逃避潜伏期 经过4d寻找隐匿平台的训练,8组动物的逃避潜伏期均下降,如表1-1所示。重复测量方差分析显示时间效应有统计学意义(P<0.001);组间两两比较显示,逃避潜伏期正交设计第4组低于第5组(P<0.05);其他各组之间两两比较相似,差异没有显著性。1.2记忆成绩数据(5d游过平台的次数)的正交实验结果及分析表1-2 小鼠Morris水迷宫实验第5d游过平台的次数正交实验结果 表1-2.为小鼠第5d游过平台的次数正交实验结果,此结果用于后面一系列正交分析,以之得出药物作用的排列次序(以药物的正的贡献率为准)。1.3小鼠第5d游过平台的次数正交结果的方差分析表表1-3 小鼠Morris水迷宫实验第5d游过平台的次数正交实验结果的方差分析 表1-3为小鼠第5d游过平台的次数正交实验结果的方差分析,此结果提示实验结果的变异来源于分组之间(P<0.01),而不是来源于次间(每批次动物的差别,P>0.05)。说明此正交实验正确有效,通过了正交实验设计标准的检验。1.4小鼠第5d游过平台的次数正交结果的析因分析表1-4 小鼠第5d游过平台的次数正交结果的析因分析 注有=1,无=-1表1-5 小鼠第5d游过平台的次数析因分析结果的方差分析 此两表(表1-4、表1-5)为小鼠第5d游过平台的次数正交实验结果的析因分析。由表中可以看出,在析因分析的方差分析中,A药的P=0.0002<0.001,然而其贡献率值为负值(-38),说明A药在实验中虽具有重要作用但为负的作用,应予丢弃。因为本实验要求的结果应为药物的正的贡献率为准(即小鼠第5d游泳经过已撤除隐匿平台区的次数越多越好),所以根据实验结果正贡献率将各个药物依次排列为C>G>E>B>F>D>A。2小鼠的海马匀浆乙酰胆碱酯酶(TachE)活性的检测结果的正交分析2.1小鼠的海马匀浆乙酰胆碱酯酶(TachE)活性的检测结果及分析表1-6 小鼠海马匀浆乙酰胆碱酯酶(TachE)活性的正交实验结果 表1-6为小鼠的海马匀浆乙酰胆碱酯酶(TachE)活性的检测结果正交实验结果,此结果用于后面一系列正交分析,以之得出药物作用的排列次序(以药物的正的贡献率为准)。2.1.2小鼠的海马匀浆TachE活性的检测正交结果的方差分析表表1-7 小鼠海马匀浆乙酰胆碱酯酶(TachE)活性的正交实验结果的方差分析 表1-7为小鼠的海马匀浆乙酰胆碱酯酶(TachE)活性检测结果的方差分析,此结果提示结果的变异来源于分组之间(P<0.001),而不是来源于次间(每批次动物的差别,P>0.05)。说明此正交实验正确有效,通过了正交实验设计标准的检验。2.1.3小鼠的海马匀浆TachE活性的检测正交结果的析因分析表1-8 小鼠的海马匀浆TachE活性的检测正交结果的析因分析 注有=1,无=-1 表1-9小鼠的海马匀浆TachE活性的检测析因分析结果的方差分析此两表(表1-8、表1-9)为小鼠的海马匀浆TachE活性的检测正交结果的析因分析,因为本实验要求的结果应为药物的正的贡献率为准(即药物对小鼠的海马匀浆TachE活性作用越明显越好),所以根据实验结果正贡献率的排列次序为C>E>G>B>F>A>D。并且C、E、G在析因分析的方差分析中,C药的P=0.0003<0.001,E药的P=0.0046<0.01,G药的P=0.0294<0.005,说明此三味药在实验中具有重要作用。3.实施例1的结果小结根据第5d小鼠游泳经过平台的次数,上述A-G药依次排列为C>G>E>B>F>D>A;同样根据检测的小鼠海马匀浆中的真性胆碱酯酶(TachE)活性检测的结果,上述A-G药依次排列为C>E>G>B>F>A>D。利用正交分析助手(Ver3.2)进行验算,根据正交分析的结果和各个药物的效应曲线,选择CEG作为重点研究,CE为主药(正效应,剂量越大越好),G为调整药(负效应,剂量越小越好)。C人参、E远志、G石菖蒲。实施例2以学习记忆障碍动物模型,验证中药Q0409筛选方(CE±G)的效果(石杉碱甲作为对照药物)昆明小鼠雌雄分笼饲养,每天自由饮食、饮水,并定时换垫料,以维持小鼠生活环境清洁卫生。同时每天定时给各组小鼠灌胃相应的中药溶液。中药免煎颗粒剂,根据实施例1结果选择CEG作为重点研究,CE为主药(正效应,剂量越大越好),G为调整药(负效应,剂量越小越好)。C远志;E人参;G石菖蒲。用双蒸水配制成不同配伍的中药溶液远志(C,0.286g·mL-1),人参(E,0.238g·mL-1),石菖蒲(G,0.286g·mL-1);石杉碱甲溶液,终浓度约为3.8μg·mL-1。将动物随机分组1组空白对照组2组CE+G(大剂量)组3组CE+G(小剂量)组4组CE组5组阳性药物对照组(石杉碱甲组)6组模型组各组小鼠每天灌胃相应剂量中药溶液,对照组和模型组灌胃相同体积的双蒸水,阳性药物对照组灌胃相应剂量石杉碱甲溶液,连续14d。第15d-19d每天继续如前,先灌胃相应剂量中药、石杉碱甲溶液和双蒸水,1h后,每只小鼠再腹腔注射东莨菪碱(2mg/kg)后30min,开始进行Morris水迷宫实验。测试结果1.小鼠Morris水迷宫实验的行为学指标分析1.1学习成绩数据的分析表2-1 各组动物每天在定位航行实验中逃避潜伏期 注C远志;E人参;G石菖蒲。*P<0.05,vs control group;△P<0.05,vs模型组;见表2-1示,经过4d寻找隐匿平台的训练,6组动物的逃避潜伏期均下降,重复测量方差分析显示时间效应有统计学意义(P<0.001)。空白对照组与模型组比较,模型组的逃避潜伏期长于空白对照组,差异有显著性(P<0.05),提示模型复制成功。与空白对照组之间比较,除模型组之外,其余各组与空白对照组之间无显著性差异(P>0.05);与模型组之间比较,CE+G(大剂量)组、CE+G(小剂量)组、CE组、石杉碱甲组的逃避潜伏期均低于模型组,但是仅CE组有显著性差异(P<0.05),其余各组与模型组之间相比,差异没有显著性。1.2小鼠Morris水迷宫记忆成绩表2-2 第五天游泳经过平台次数及目标象限停留时间(x±s) *P<0.05,vs control;△P<0.05,vs模型组经过4d寻找隐匿平台的学习训练,第5d进行记忆实验,结果见表2-2示,小鼠第5d目标象限停留时间和经过平台次数,空白对照组与模型组比较,空白对照组的目标象限停留时间长于模型组、经过平台次数多于模型组,差异均有显著性(P<0.05),提示模型复制成功。与空白对照组之间比较,模型组、CE+G(大剂量)组的目标象限停留时间短于空白对照组,CE+G(大剂量)组、CE+G(小剂量)组的经过平台次数少于空白对照组,差异有显著性(P<0.05),其余各组与空白对照组之间相比,差异没有显著性。与模型组之间比较,空白对照组、CE组、石杉碱甲组的目标象限停留时间长于模型组,空白对照组、CE组、石杉碱甲组的经过平台次数多于模型组,差异有显著性(P<0.05),其余各组与模型组之间相比,差异没有显著性。1.2小鼠的海马匀浆乙酰胆碱酯酶(TchE)活性的检测表2-3 各组动物脑组织TchE活性含量的比较(x±s) △P<0.05,vs control,*P<0.05,vs模型组见表2-3,小鼠的海马匀浆乙酰胆碱酯酶(TchE)活性的检测结果,空白对照组与模型组比较,模型组的海马匀浆乙酰胆碱酯酶(TchE)活性高于空白对照组差异有显著性(P<0.05),提示模型复制成功。与空白对照组之间比较,模型组、CE+G(大剂量)组、CE+G(小剂量)组的乙酰胆碱酯酶(TchE)活性明显高于空白对照组,差异有显著性(P<0.05),其余各组与空白对照组之间相比,差异没有显著性(P>0.05)。与模型组之间比较,空白对照组、CE组、石杉碱甲组的乙酰胆碱酯酶(TchE)活性低于模型组,差异有显著性(P<0.05),其余各组与模型组之间相比,差异没有显著性。2.实施例2结果小结根据本实验结果,可以判断中药Q0409初步筛选方中的远志、人参合用时,可以明显改善东莨菪碱诱导的小鼠学习记忆障碍的模型,而加入石菖蒲之后,我们发现石菖蒲剂量越大,效果越差;剂量越小,效果越好。与前面的正交设计的验算的结论一致,即石菖蒲在此筛选方的作用是负效应,应予以剔除。所以,我们确定中药Q0409初步筛选方为2味药远志、人参。实施例3利用学习记忆动物障碍模型药物的进行最佳剂量的研究昆明小鼠雌雄分笼饲养,每天自由饮食、饮水,并定时换垫料,以维持小鼠生活环境清洁卫生。同时每天定时给各组小鼠灌胃相应的中药溶液。中药免煎颗粒剂,根据实施例2结果选择CE作为重点研究。C远志;E人参;G石菖蒲。用双蒸水配制成不同配伍的中药溶液远志(C,0.286g·mL-1),人参(E,0.238g·mL-1),石菖蒲(G,0.286g·mL-1);石杉碱甲溶液,终浓度约为3.8μg·mL-1。将动物随机分组1组空白对照组2组模型组3组CE(低剂量) 4组CE(中剂量)5组CE(高剂量)6组阳性药物对照组(石杉碱甲组)各组小鼠每天灌胃相应剂量中药溶液,对照组和模型组灌胃相同体积的双蒸水,阳性药物对照组灌胃相应剂量石杉碱甲溶液,连续14d。第15d-19d每天继续如前,先灌胃相应剂量中药、石杉碱甲溶液和双蒸水,1h后,每只小鼠再腹腔注射东莨菪碱(2mg/kg)后30min,开始进行Morris水迷宫实验。1小鼠Morris水迷宫实验的行为学指标分析1.1小鼠Morris水迷宫学习成绩的分析见表3-1示,经过4d寻找隐匿平台的训练,6组动物的逃避潜伏期均有下降,重复测量方差分析显示时间效应有统计学意义(P<0.001)。空白对照组与模型组比较,模型组的逃避潜伏期长于空白对照组,差异有显著性(P<0.01),提示模型复制成功。与空白对照组之间比较,除模型组之外,CE(高剂量)组、CE(低剂量)组的逃避潜伏期均长于空白对照组,差异有显著性(P>0.05),其余各组与空白对照组之间相比,差异没有显著性。与模型组之间比较,CE(中剂量)组、石杉碱甲组的逃避潜伏期均低于模型组,其余各组与模型组之间相比,差异没有显著性,其余各组与模型组之间相比,差异没有显著性。表3-1 各组动物每天在定位航行实验中逃避潜伏期的比较 注C远志;E人参。*P<0.05,vs control group;△P<0.05,vs模型组;1.2小鼠Morris水迷宫记忆成绩表3-2 第五天游泳经过平台次数及目标象限停留时间(x±s) *P<0.05,vs control;△P<0.05,vs模型组;经过4d寻找隐匿平台的学习训练,第5d进行记忆实验,结果见表2-1示,小鼠第5d目标象限停留时间和经过平台次数,空白对照组与模型组比较,模型组的目标象限停留时间长于空白对照组、经过平台次数多于空白对照组,差异有显著性(P<0.05),提示模型复制成功。与空白对照组之间比较,模型组、CE(低剂量)组的目标象限停留时间短于空白对照组,模型组、CE(低剂量)组的经过平台次数少于空白对照组,差异有显著性(P<0.05),其余各组与空白对照组之间相比,差异没有显著性。与模型组之间比较,空白对照组、CE(中剂量)组、石杉碱甲组的目标象限停留时间长于模型组,空白对照组、CE(中剂量)组、CE(高剂量)组、石杉碱甲组的经过平台次数多于模型组,差异有显著性(P<0.05),其余各组与模型组之间相比,差异没有显著性。2.2小鼠的海马匀浆乙酰胆碱酯酶(TachE)活性的检测结果表3-3 各组动物脑组织TachE活性含量的比较(x±s) △P<0.05,vs control,*P<0.05,vs模型组见表3-3,小鼠的海马匀浆乙酰胆碱酯酶(TachE)活性的检测结果,空白对照组与模型组比较,模型组的海马匀浆乙酰胆碱酯酶(TachE)活性低于空白对照组,差异有显著性(P<0.05),提示模型复制成功。与空白对照组之间比较,模型组、CE(低剂量)组的海马匀浆乙酰胆碱酯酶(TachE)活性高于空白对照组,差异有显著性(P<0.05),其余各组与空白对照组之间相比,差异没有显著性。与模型组之间比较,空白对照组、CE(中剂量)组、石杉碱甲组的的海马匀浆乙酰胆碱酯酶(TachE)活性明显低于模型组,差异有显著性(P<0.05),其余各组与模型组之间相比,差异没有显著性。3.实施例3结果小结再次验证中药Q0409筛选方(人参和远志)的作用,并摸索此方的剂量和效应关系,实验结果证实中剂量组中药效果最好,与阳性对照药物组(石杉碱甲组)差异无显著性,而高剂量组、低剂量效果则依次降低,巧合的是,此最佳剂量即为根据人服药剂量换算得出的小鼠正常灌胃剂量。实施例4向病人(成人,体重60Kg)给药人参1~50g/天,远志1-50g/天,每14天为1个疗程,间隔7天,连续服药3-100疗程。权利要求1.一种改善学习记忆能力和防治学习记忆障碍的中药,其特征在于由以下两味原料药物组成人参,远志。2.根据权利要求1所述的中药,其特征在于所述原料药物的重量比为人参1~50份,远志1~50份。3.根据权利要求1所述的中药,其特征在于所述原料药物的重量比为人参8~12份,远志10~14份。4.根据权利要求1所述的中药,其特征在于所述原料药物的重量比为人参10份,远志12份。5.根据权利要求1所述的中药,其特征在于所述人参为山参、红参、圆参或党参,花旗参;所述远志为细叶远志或卵叶远志。6.根据权利要求1所述的中药,其特征在于所述中药采用常规加工方法制成口服液、胶囊、片剂或提取物再混合剂型。7.一种改善学习记忆能力和防治学习记忆障碍的中药,其特征在于由以下重量比的原料药物组成三七1~50份,远志1~50份。8.一种改善学习记忆能力和防治学习记忆障碍的中药,其特征在于由以下重量比的原料药物组成西洋参1~50份,远志1~50份。全文摘要本发明公开了一种改善学习记忆能力和防治学习记忆障碍的中药,由以下两种药物组成的组方人参和远志。所述中药可采用常规加工方法制成口服液、胶囊、片剂、提取物再混合等剂型。实验证明,本发明的中药新方可对抗胆碱药物——东莨菪碱小鼠腹腔注射后引起的记忆获得障碍,是具有益智作用的中药新方。与其他益智中药复方的相比,还有如下优点实验结果重复性好,效果肯定;仅有2味中药,组方药物少;容易获取、方便且便宜。文档编号A61P25/00GK101045087SQ200710027878公开日2007年10月3日 申请日期2007年5月8日 优先权日2007年5月8日发明者陆大祥, 戚仁斌, 王华东 申请人:暨南大学
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